Оптогенетические измерения

Суть оптогенетики заключается во введении активируемых светом рекомбинантных ионных каналов, таких как канальный родопсин (ChR2) или галородопсин (NpHR), в возбуждаемые клетки. Световая активация этих молекул приводит к притоку ионов, что вызывает выборочное включение или выключение нейронов. Галородопсин и канальный родопсин вместе позволяют проводить оптическую активацию на разных длинах волн, выключение генов и десинхронизацию нервной деятельности, создавая мощный инструментарий для нейроинженерии. Фотостимуляция может быть индуцирована с использованием видимого или инфракрасного света, а сканирование выполняется с помощью фемтосекундного ИК-лазера. Переключение между стимуляцией и визуализацией осуществляется за время менее миллисекунды. Также важно отметить, что детекторы защищены во время стимуляции встроенной системой стробирования.

3D визуализация и фотостимуляция

Фотостимуляцию можно чередовать с визуализацией, выбрав область сканирования, покрывающую одну или несколько сом, расположенных в любом месте трехмерного поля зрения,, с помощью расширения FEMTO3D Atlas Dichro. Стимуляция может быть выполнена в улучшенном режиме анализа 3D Chessboard scanning, который расширяет режим трехмерного произвольного поточечного сканирования, когда точки анализа расширяются до небольших квадратов. Однородное распределение энергии стимуляции по сомам выбранных клеток позволяет получать максимальную эффективность стимуляции, тем самым сводя к минимуму возможность фотоповреждения клеток-мишеней. Лазерный луч, используемый для фотостимуляции, возбуждает канальный родопсин, экспрессированный в клетках, вызывая контролируемый всплеск потенциалов действия. Для сканирования кальция можно выбрать второй шаблон сканирования с более крупными зонами, охватывающий клеточные тела вместе с окружающими их областями, в которых вызванная активность может отслеживаться даже во время перемещений образца. Время фотостимуляции и визуализации можно точно контролировать с помощью различных протоколов программного обеспечения.

Клетки, экспрессирующие ChrimsonR-mRuby2 и GCaMP6f, стимулировали и сканировали в режиме анализа 3D Chessboard scanning в коре головного мозга мыши in vivo. Красный квадрат: стимуляция клетки размером 10×10 мкм; зеленые квадраты: визуализация клеток размером 25×25 мкм. Клетки в плоскости сканирования выделены рамками с непрерывной линией; клетки других выделены рамками с пунктирной линией. Для повышения эффективности стимуляцию выполняли десятью импульсами длительностью 1 мс с частотой повторения 10 Гц, а визуализацию с частотой 12 Гц.