Двухфотонный лазерный 3D сканирующий микроскоп FEMTO3D Atlas

FEMTO3D Atlas представляет собой трехмерный двухфотонный лазерный сканирующий микроскоп, построенный на основе акустооптических дефлекторов (AOD), который объединяет в себе высокие технологии и уникальные инженерные решения в области трехмерных измерений. Данный микроскоп выходит за рамки получения изображений с помощью стандартных гальвано- и резонансных сканеров и, с за счет AOD технологии, объединяет их потенциал с уникальной функцией быстрой 3D-визуализации, предоставляя ультрасовременное решение для ученых и исследователей. FEMTO3D Atlas позволяет сканировать нейронные, дендритные или другие биологические процессы в 3D, в миллион раз быстрее, чем классические методы сканирования, но с сохранением двухфотонного разрешения.

• Расширение в область 3D анализа для любых существующих микроскопов и отдельных систем
• Одновременное считывание нейронной активности как на соматическом, так и на дендритном уровне
• Увеличение скорости измерения и отношения сигнал/шум на несколько порядков
• Трехмерное отображение распределения более 2000 сом (совокупности клеток организма)
• Сканирование дендритных ветвей через слои
• Одновременное сканирование более тысячи дендритных шипиков
• Гибкие методы сканирования in vivo и in vitro
• 3D коррекция движения с помощью специализированных сканирующих методов
• Высокоскоростное 3D сканирование любой интересующей области: скорость до 30 кГц
• Высокоскоростное растровое сканирование: 40 кадров в секунду для 500 × 500 мкм; до 3000 кадров в секунду приуменьшенном поле зрения
• Улучшенная эффективность возбуждения для большого объема 3D сканирования
• Автоматическая подстройка длины волны в диапазоне 750 – 1050 нм
• Автоматическая стабилизация луча лазера
• Корреляция функционального сканирования с электрофизиологическими данными
• Произвольная 3D-фотостимуляция для оптогенетики
• Одновременная 3D-визуализация и 3D-фотостимуляция

• Сканирование нейронных сетей: нейронные сети, состоящие из тысяч нейронов, распределены в объеме пространства, зачастую по различным корковым слоям мозга. Произвольное трехмерное сканирование, выполняемое по акустооптической технологии, является лучшим выбором для выявления динамики нейронных сетей при обработке информации. Это позволяет регистрировать активность нейронов в клеточных популяциях, состоящих из тысяч клеток, методом in vivo. Трехмерная технология защиты от движения в сочетании с новыми методами сканирования, объединенными в FEMTO3D Atlas, предоставляет гибкое решение для сбора данных с коррекцией движения в больших объемах при высоких скоростях сканирования.
• Сканирование дендритов: трехмерное сканирование точек с произвольным доступом, расширенное за счет смещения фокальной точки по коротким трехмерным траекториям, позволяет получать изображения без прерывания на нескольких дендритных ветвях. Во время смещения процесс анализа непрерывен, поэтому данный режим сканирования дает более детальное пространственное разрешение без изменения общего времени сканирования, которое сопоставимо с тем, что и при обычном точечном сканировании. В результате может быть выявлена функция тонких дендритных сегментов или даже дендритных шипиков.
• Изучение поведенческих характеристик: наша технология защиты от движения позволяет отслеживать активность клеток, когда животное движется в виртуальной реальности и выполняет задачи. Для сохранения сигналов точки сканирования расширяются до линий смещения, которые точно подогнаны друг к другу, в результате чего элементы поверхности или объема охватывают целевой объект. Эти элементы охватывают не только предварительно выбранные области интереса, но и соседние области, что дает возможность для коррекции движения, сохраняя всю флуоресцентную информацию во время движений и уменьшая артефакты более чем на один порядок в поведении животных.
• Оптогенетические измерения: методы фотостимуляции позволяют селективно и точно активировать клетки, что делает их полезными для различных биологических применений, начиная от исследований синаптической пластичности до экспериментов, изучающих процессы обучения и памяти in vivo. К расширению FEMTO3D Atlas Dichro может быть подключен второй лазер, позволяющий выполнять оптогенетическую стимуляцию или освобождение из клеток с помощью сканирования кальция одновременно даже в разных клеточных популяциях

Новейшей особенностью микроскопа FEMTO3D Atlas являются электрически перестраиваемые акустооптические дефлекторы (AOD), которые отвечают за фокусировку по осям X, Y и Z. Эти дефлекторы не содержат сканирующих зеркал или каких-либо других медленно движущихся механических компонентов, поэтому процесс фокусировки рабочего пятна является быстрым, гибким, стабильным и не зависит от расстояния. Такая свобода позиционирования обеспечивает чрезвычайно высокую скорость сканирования – до 30 кГц в любой точке трехмерного пространства в объеме кубического миллиметра под объективом.

Благодаря данной технологии нам удалось создать и объединить такие методы сканирования, которые делают FEMTO3D Atlas уникальным решением на мировом рынке:

• Произвольное трехмерное сканирование (3D ROI Scanning): AOD технология в сочетании с простым в использовании программным обеспечением для сбора данных предоставляет максимальную гибкость в быстром выборе интересующих для анализа трехмерных областей (ROI) с различными формами и размерами, такими как точки, траектории, плоскости и т.п. На заранее выбранные ROI можно точно и быстро наводиться без потери времени измерения на ненужном фоне, увеличивая дальнейшую скорость измерения до 30 кГц и соотношение сигнал/шум на несколько порядков по сравнению с классическим растровым сканированием.

• Трехмерная коррекция движения (3D Anti-motion): новые методы трехмерного сканирования микроскопа FEMTO3D Atlas позволяют собирать всю интересующую флуоресцентную информацию о поведении из интересующих областей мозга во время движения животных, выполняющих задачи в виртуальной реальности. Для сохранения флуоресцентных сигналов во время движения, точки сканирования расширяются в 3D до плоских или объемных элементов, при этом всегда окружая целевой объект. При этом поддерживается частота сканирования в диапазоне 10 – 1000 Гц, необходимая для разрешения нейронной активности в отдельных областях интереса – это позволяет корректировать артефакты движения in vivo в точном пространственном масштабе.

• Высокоскоростное произвольное сканирование (High-speed arbitrary frame scanning): высокоскоростной режим растрового сканирования микроскопа FEMTO3D Atlas обеспечивает скорость сканирования 40 кадров в секунду при размере изображения 510 × 510 пикселей для площади 500 × 500 мкм. Это быстрее, чем у большинства сканирующих многофотонных микроскопов с резонансными сканерами, чья максимальная скорость составляет около 30 кадров в секунду. Благодаря AOD технологии плоскость сканирования может быть выбрана произвольно при сохранении скорости: плоскость быстрого сканирования может быть перпендикулярна оси объектива или лежать под произвольным углом в оси X и/или Y.

• Трехмерная фотостимуляция (3D Photostimulation): при использовании трехмерной произвольной стимуляции в модификации FEMTO3D Atlas Dichro, доступны методы сканирования с гибкими параметрами для фотостимуляции. В зависимости от выбранного режима сканирования пользователи могут стимулировать частично распределенные отдельные клетки или дендритные процессы в большом объеме с высокой точностью. Быстрое переключение между двумя лазерными линиями позволяет регистрировать активность практически одновременно с фотостимуляцией. Использование одной сканирующей головки для визуализации и фотостимуляции делает данную функцию экономически выгодной и простой в настройке.

• Трехмерная визуализация (3D Imaging): FEMTO3D Atlas может быть объединен с уже существующими вертикальными микроскопами благодаря подстраиваемой станине. Таким образом, микроскоп позволяет расширять существующие системы с возможностью быстрой функциональной трехмерной визуализации. Кроме того, FEMTO3D Atlas может работать и как отдельная система: наша базовая платформа Femtonics 2P была разработана исключительно для FEMTO3D Atlas. Микроскоп имеет встроенный блок стабилизации лазерного луча, который устраняет все виды оптических ошибок, вызванных тепловым дрейфом, движением, износом лазерной системы или любым другим отклонением вблизи акустооптических дефлекторов.