Трехфотонная визуализация

Трехфотонная (3P) микроскопия является не инвазивным методом анализа и позволяет получать функциональные изображения, делая клетки видимыми в глубоких тканях, с высоким пространственным разрешением и лучшей контрастностью по сравнению с двухфотонным возбуждением. Оптический дизайн, необходимый для 3P-возбуждения, обеспечивает более высокое осевое разрешение, а также трехфотонное возбуждение различных флюорофоров, таких как генетически кодированные индикаторы кальция на основе белка (например, GCaMP6). Кроме того, частота следования импульсов используемых лазерных источников достаточна для визуализации переходных процессов Ca²⁺, получаемых в результате нейронной активности.

Микроскоп FEMTOSmart Galvo, оснащенный модулем для трехфотонного возбуждения, позволяет производить возбуждение в диапазоне длин волн 1200 – 1700 нм. Более длинные длины волн меньше рассеиваются в биологических тканях, что позволяет увеличить глубину проникновения, уменьшить возбуждение вне фокуса и увеличить отношение сигнал/шум. На рисунке ниже представлено измерение флуоресцентной активности нескольких сом из области V1 мыши, меченной с помощьюGCaMP6.

Генерация третьей гармоники

Генерация третьей гармоники (THG) – это особый эффект 3P-возбуждения, который является результатом преобразования трех падающих фотонов на входе в один фотон испускания на выходе с утроенной энергией и, следовательно, испусканием света с длиной волны, равной одной третьей части от длины волны падающего излучения. THG возникает на структурных границах раздела, которые образуются между водными жидкостями и липидными структурами, например, биологическими мембранами или водой и крупными белковыми агрегатами, такими как коллагеновые клубки или мышечные волокна. На рисунке ниже представлено изображение сечения почки мыши: клетки почки возбуждались на длине волны 1500 нм, а испущенные фотоны регистрировались в зеленом канале (≈ 500 нм) детектора.